Électrophorèse sur gel d'agarose, comment ça marche et ses utilisations

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Des lois simples de la physique dictent que lorsqu’un courant est appliqué à un milieu contenant des espèces chargées, ces espèces migrent vers la charge opposée. Selon le milieu dans lequel ils se déplacent, d’autres caractéristiques – comme la taille des espèces présentes – peuvent avoir un impact sur leur déplacement, conduisant à une séparation. C’est sur cette base que sont construites les techniques d’électrophorèse, telles que l’électrophorèse sur gel d’agarose, techniques largement utilisées dans les sciences de la vie.

Dans cet article, nous examinerons le fonctionnement de l’électrophorèse sur gel d’agarose, comment elle peut être interprétée et certains de ses objectifs.

L'électrophorèse est une technique qui utilise le courant électrique pour séparer l'ADN, l'ARN ou les protéines en fonction de leurs propriétés physiques telles que la taille et la charge.

L'électrophorèse sur gel d'agarose est une forme d'électrophorèse utilisée pour la séparation de fragments d'acide nucléique (ADN ou ARN) en fonction de leur taille. L'ADN/ARN chargé négativement migre à travers les pores d'un gel d'agarose vers l'extrémité chargée positivement du gel lorsqu'un courant électrique est appliqué, les fragments plus petits migrant plus rapidement. Les bandes résultantes peuvent ensuite être visualisées à l’aide de la lumière ultraviolette (UV).

L’ARN1 a cependant tendance à former des structures secondaires – parfois plusieurs espèces différentes pour le même fragment – ​​qui affectent sa façon de migrer. Par conséquent, les bandes observées ne représentent pas toujours leur taille réelle et les images sont floues. Les gels d'agarose natifs (où les conditions ne perturbent pas les structures naturelles des analytes) ont donc tendance à ne pas être utilisés pour l'analyse de la taille des ARN, bien qu'ils puissent donner une estimation de la quantité et de l'intégrité. Les alternatives incluent le Northern Blot et l’électrophorèse dénaturante sur gel d’agarose2 qui utilisent des conditions capables de perturber les structures secondaires.

Les gels d'agarose peuvent également être utilisés pour séparer les protéines3 en fonction de leur taille et de leur charge (contrairement à l'ADN/ARN, la charge des protéines varie en fonction des acides aminés incorporés). Cependant, en raison de la grande taille des pores des gels d'agarose, les protéines sont souvent séparées sur des gels de polyacrylamide qui ont des pores plus petits, offrant une plus grande résolution pour les petites molécules de protéines.

Nous nous concentrerons donc sur l’électrophorèse sur gel d’agarose ADN pour la suite de cet article.

L'agarose est un composant de l'agar. Il forme une matrice de gel 3D de molécules d'agarose hélicoïdales en faisceaux super-enroulés maintenus par des liaisons hydrogène, avec des canaux et des pores à travers lesquels les molécules peuvent passer. Lorsqu'elles sont chauffées, ces liaisons hydrogène se brisent, transformant l'agarose en liquide et lui permettant d'être versé dans un moule avant qu'il ne se réinitialise (Figure 1).

Le pourcentage d'agarose inclus dans un gel a un impact sur la taille des pores et donc sur la taille des molécules qui peuvent le traverser et la vitesse à laquelle elles le traversent. Plus le pourcentage d’agarose est élevé, plus la taille des pores est petite, donc plus les molécules capables de passer sont petites et plus la migration est lente. Dans le laboratoire de biologie moléculaire, un gel d'agarose à 0,7-1 % est généralement utilisé pour les séparations quotidiennes de l'ADN, offrant une différenciation bonne et claire des fragments dans la plage de 0,2 à 10 kb. Les fragments plus gros peuvent être résolus à l'aide de gels à faible pourcentage, mais ils deviennent très fragiles et difficiles à manipuler, tandis que les gels à pourcentage plus élevé donneront une meilleure résolution des petits fragments mais sont fragiles et peuvent durcir de manière inégale.

L'électrophorèse sur gel est utilisée pour séparer des mélanges de biomacromolécules, telles que l'ADN, l'ARN et les protéines. Cette technique sépare par taille moléculaire et/ou charge. Ceci est réalisé en faisant passer des molécules à travers un gel contenant de minuscules pores à l’aide d’un champ électrique.

L’ADN n’étant pas visible à l’œil nu, un colorant intercalant tel que le bromure d’éthidium (EtBr) est incorporé au gel lors de la prise. Cela lie l’ADN et émet une fluorescence sous la lumière UV, permettant ainsi de visualiser les fragments d’ADN. Plus il y a d’ADN présent, plus le groupe est brillant.